转自：东富龙
引言
蛋白质是保证人体健康最重要的营养素之一。随着人们对于生活水平的要求不断提高，根据数据统计，未来食品蛋白消费需求会不断增加，但是现有的蛋白质获取方式难以满足实际的蛋白需求。现代生物技术为食品蛋白的开发和加工提供了新的有效手段，基因重组技术和发酵工程实现了各种重组食品蛋白的开发和大规模生产；而对于食品蛋白的纯化，包括提取与沉淀分离技术、过滤与膜分离技术、层析分离技术等在内现代生化技术起到重要作用，其中层析分离是提高蛋白纯度的一项关键技术，近年来在食品行业中的应用越发广泛，并展现出其突出的应用效果，本文我们将通过一些食品蛋白纯化工艺案例进行相关探讨与分享。
乳铁蛋白纯化工艺
乳铁蛋白是一种相对分子量约为80kDa的铁结合蛋白，属于转铁蛋白的一种。乳铁蛋白通过螯合铁在抗菌性能方面具有明显优势，且作为抵御病原体的第一道防线，有效地破坏细胞膜的完整性，并通过限制铁的可用性来抑制微生物的增殖，这有助于先天免疫反应，特别是保护婴幼儿的免疫损伤。除抗菌活性外，乳铁蛋白还对多种病毒具有抗病毒活性，以及抗癌和抗氧化作用。此外，它还可以通过影响巨噬细胞和淋巴细胞的功能和增强免疫反应与其相互作用，并具有抗炎特性，有助于缓解各种组织中的炎症，还可以调节炎症介质活性并参与组织修复过程[1]。也正是因其具有以上免疫调节、抗菌活性、抗炎作用等生物学作用，乳铁蛋白在食品、化妆品和制药行业有着广泛的应用。
目前，乳铁蛋白的提纯分为天然提取法和重组乳铁蛋白提取法。天然提取大多采用牛乳种提取的方式，但存在牛奶需求量大，蛋白表达量低，提取工艺复杂等缺点。而微生物可以通过重组基因技术合成乳铁蛋白，近年来合成生物系统的发展增加了使用微生物制备大量乳铁蛋白的可行性，不同物种的乳铁蛋白已在常见的原核和真核系统以及其他表达系统中成功表达，重组乳铁蛋白已成为目前乳铁蛋白生产的研究热点和发展趋势。
天然乳铁蛋白的提取
乳铁蛋白在牛奶中自然表达，平均浓度为0.1至0.2 g/L，牛初乳中约含有1.5 g/L，目前从牛奶中提取的主要方法是先经过前处理分离脂肪和乳清，再通过离子交换的方式在乳清中提取得到乳铁蛋白。以下案例采用SP Purose 6BB离子交换层析实现了牛乳中乳铁蛋白的提纯，最终纯度为85%，收率为83%。
表1. SP Purose 6BB信息表
重组乳铁蛋白的纯化
重组乳铁蛋白可以选择酵母表达系统，其特点是表达量较高，并且由于是分泌表达，所以不需要细胞破碎的过程，只需要离心或者过滤去除细胞即可实现目标产物的前处理工作，其中过滤一般会用到切向流过滤膜包起到澄清的作用，旨在去除大分子杂质，降低料液浊度，为后续纯化步骤降低生物负荷。
图2. 重组乳铁蛋白纯化工艺流程
下图案例为酵母表达系统表达的乳铁蛋白，经过工艺优化，最终选用的是离子交换填料SP Purose 6XL, 上样浓度5g/L, 共上样20CV，收集洗脱液进行后续纯化步骤。结果如下图所示，最终得到纯度为98.3%，收率95%的目标产物，满足实际生产需求。
SDS-PAGE纯度图(中)，液相图(右)
表2. SP Purose 6XL信息表
甜蛋白纯化工艺
甜味蛋白是一类从植物中发现的具有甜味的蛋白质，具有高甜度，低热量，安全性高等优点，是在食品工业中越发受到重视的一种天然、安全的甜味剂。目前已发现的植物甜味蛋白主要有8种，分别是索马甜（Thaumatin）、巴西甜蛋白（Brazzein）、莫奈林（Monelin）、仙茅甜蛋白（Curculin）、马槟榔甜蛋白（Mabinlin）、培它丁（Pentadin）、奇果蛋白（Miraculin）、Neoculin[2]。
在甜味蛋白开发前期，主要是从天然植物中提取，但这些植物大多处于热带地区，而且从植物中提取产量低、成本高、稳定性较差[3]。随着现代生物技术的发展，食品工业中越发趋向于利用基因工程技术开发重组甜蛋白，并进行大规模发酵生产，并应用膜分离技术和层析分离技术得到高纯度的甜味蛋白成品，以下案例展示了某种甜味蛋白的纯化工艺。
下图案例的重组甜蛋白是由酵母胞外表达的，料液前处理主要是离心和过滤去除细胞。通过工艺优化，最终确认色谱工艺为SP Purose 6XL阳离子交换一步法，而后使用超滤膜包进行浓缩透析，进一步去除一些小分子杂质，并得到脱盐后的最终产物，最终纯度约为99.3%，收率95%，满足实际生产需求。
SDS-PAGE纯度图(中)，液相图(右)
结语
以上，通过乳铁蛋白和甜味蛋白的纯化工艺案例，可以看到以层析技术为核心的分离纯化工艺为食品领域内的蛋白纯化提供了高效的解决方案。在未来，基因重组技术在食品工业中的应用范围将会继续扩大，重组食品蛋白将作为重要力量应对不断增长的食品蛋白需求挑战。东富龙生命科技专注于生物大分子纯化介质开发与纯化技术应用，在食品蛋白纯化领域具有丰富的经验，致力于生产符合行业标准和要求的食品蛋白增添技术力量。
[1]张雷，王文利，程智美，等. 乳铁蛋白生理活性及作用机理研究进展[J]. 食品工业科技，2021，42（9）：388−395. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2020060152
[2]何明娟，邹曙明，蒋霞云，刘宁.甜味蛋白特性及其表达的研究进展. 生物化工，2018,年10月，第4卷 第5期，文章编号：2096-0387(2018)05-0105-04
[3]施天元 ，曹国强. 基因工程表达甜味蛋白的研究进展 [J]. 食品工业科技，2023，44（2）：453−459. doi: 10.13386/j.issn10020306.2022020262
（转自：东富龙）
