胶原蛋白纯化工艺开发及优化

转自：楚天人

楚天微球

胶原蛋白是一种生物高分子蛋白质，属于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的主要组成成分之一。它在人体中广泛存在，具有高度的抗拉强度和韧性，为皮肤、骨骼、肌腱、韧带和其他结缔组织提供结构支持和机械稳定性，如今被广泛应用于医药、化妆品和食品工业中。

胶原蛋白分子由三条多肽链（α-链）组成，这些链以特定的方式缠绕形成一个右手超螺旋结构，甘氨酸（Glycine）、脯氨酸（Proline）和羟脯氨（Hydroxyproline）是胶原蛋白中含量较高的氨基酸，这些氨基酸的存在和它们在胶原蛋白分子中的特殊排列方式，共同决定了胶原蛋白独特的物理和生物化学特性，使其在生物体中发挥关键的结构和功能作用。

胶原蛋白分为天然胶原蛋白和重组胶原蛋白两大类。天然胶原蛋白主要来源于动物结缔组织，如皮肤、骨骼、肌腱等，也可以从水生生物如鱼鳞、鱼皮和鱼骨中提取，其常见提取方法包括热水浸提法、酸碱水解法、酶解法等。而利用DNA重组技术制备的，包含人胶原蛋白特定功能域的蛋白质称为重组胶原蛋白，它通常由选定的宿主细胞（如大肠杆菌、酵母、转基因动植物等）表达系统产生，具有高纯度、高安全性、低免疫原性、特定的生物活性等特点，其中选择合适的表达体系是制备重组胶原蛋白首先需要考虑的，现阶段表达体系以大肠杆菌、酵母为主，两种表达体系的优缺点如下所示。

表1：不同重组胶原蛋白表达体系比较

为了获得高纯度的胶原蛋白，需要一套成熟的纯化工艺，在胶原蛋白纯化工艺开发时，不同来源的胶原蛋白具有特定的思路，下文将对天然胶原蛋白、大肠杆菌发酵重组胶原蛋白、酵母发酵重组胶原蛋白的常规工艺开发路线进行阐述。

天然胶原蛋白纯化工艺

天然胶原蛋白的来源多样，由于是直接从动物组织中提取，使其具有完整的生物活性和人体相容性，但同时也可能存在病原体污染和引起免疫反应的风险，其纯化工艺开发前常需要通过一系列预处理，包括原料选择、酸碱处理、酶解、沉淀等步骤，而样品经过预处理后，其纯化工艺开发思路如下：

大肠杆菌发酵重组胶原蛋白纯化工艺

大肠杆菌表达系统通常成本较低，易于遗传操作，适合快速生产，是常见的异源蛋白表达系统，而大肠杆菌发酵重组胶原蛋白的纯化工艺通常涉及以下几个关键步骤。

酵母发酵重组胶原蛋白纯化工艺

酵母表达系统在生产重组胶原蛋白方面具有翻译后修饰能力、易于规模放大、高产量、可溶性表达等特点，使酵母表达系统成为生产重组胶原蛋白的一种有吸引力的选项，以下是纯化工艺开发的一般思路：

楚天微球生物技术（长沙）有限公司（楚天微球）是楚天科技控股子公司，成立于2021年，坐落于湖南省长沙市，是一家专为生物大分子分离纯化行业提供层析介质产品和相关服务的集研发生产为一体的公司。楚天微球专注于高精度、高性能和高附加值层析介质微球的研发和生产，产品布局规划涵盖天然多糖微球、硅胶微球、聚合物微球和无机微球等，产品技术原理涵盖离子交换、疏水作用、亲和、分子筛、反相等多种层析原理。在天然胶原蛋白及重组胶原蛋白纯化工艺开发方面，楚天微球具有丰富且深厚的经验，从收到客户需求到完成工艺交付进行强监管，保证每个工艺的高稳定性及可重复性，以下为工艺设计的一般流程。

在胶原蛋白的纯化过程中，选择合适的填料对于提高纯化效率和产品质量至关重要，以下是选择填料时需要考虑的几个关键因素：

在实际应用过程中，需要通过大量实验来测试不同填料的性能，以确定特定胶原蛋白的纯化填料，表2是楚天微球胶原蛋白纯化工艺开发过程中常用的填料及其用途：

表2：常用填料种类及其用途

针对不同来源的胶原蛋白，上述填料被广泛应用于蛋白纯化工艺的开发，以下内容为使用上述各个填料工艺开发的成功案例。

案例1

重组III型胶原蛋白的蛋白单体纯化

纯化参数

层析填料

TH-S

平衡缓冲液

50mM NaAC，120mM NaCl，pH4.0

洗脱缓冲液

50mM NaAC，1M NaCl，pH4.0

清洗缓冲液

0.5M NaOH

图1：重组胶原蛋白TH-S纯化曲线

图2：

重组胶原蛋白TH-S纯化样品SDS-PAGE电泳图

此工艺的纯化目的是将胶原蛋白的单体蛋白和多聚体蛋白分开，如图2所示，原样中有明显的单体蛋白和多聚体蛋白存在，通过使用TH-S填料，在11%B洗脱条件下，此工艺能够成功得到高纯度的蛋白单体样品，此外，TH-S填料具有高刚性基质、高耐压性能，能够用于高流速、大体积处理量的工艺开发，达到缩短操作周期，提高产率的目的。

表3：工艺质量检测表

案例2

大肠杆菌重组胶原蛋白两步层析纯化

第一步层析

纯化参数

层析填料

TA-Ni FF（NTA）

平衡缓冲液

20mM Tris-HCl，200mM NaCl pH=7.5

洗脱缓冲液

20mM Tris-HCl，200mM NaCl 500mM咪唑pH=7.5

清洗缓冲液

0.5M NaOH

图3：重组胶原蛋白TA-Ni FF（NTA）纯化曲线

图4：

重组胶原蛋白TA-Ni FF（NTA）纯化样品

SDS-PAGE电泳图

第二步层析

纯化参数

层析填料

TA-Q FF

平衡缓冲液

50mM Tris-HCl，pH=7.5

洗脱缓冲液

1M NaCl

清洗缓冲液

0.5M NaOH

图5：重组胶原蛋白TA-Q FF纯化曲线

图6：

重组胶原蛋白TA-Q FF纯化样品SDS-PAGE电泳图

表4：工艺质量检测表

案例3

酵母发酵重组胶原蛋白一步层析纯化

纯化参数

层析填料

TA-SP FF

平衡缓冲液

20mM NaAc，pH=5

洗脱缓冲液

20mM NaAc，0.5M NaCl，pH=5

清洗缓冲液

0.5M NaOH

图7：重组胶原蛋白TA-SP FF纯化曲线

图8：

重组胶原蛋白TA-SP FF纯化样品SDS-PAGE电泳图

表5：工艺质量检测表

楚天微球致力于为客户提供完整的纯化工艺方案设计、售前咨询及售后产品维护，针对不同的工艺需求，有不同规格的填料可供参考，下表是上述案例所用填料的规格及货号，具体问题可咨询本公司的销售及技术支持。

楚天微球填料规格及货号