抗体荧光基团介绍和选择指南

转自：优宁维抗体专家

荧光基团是科学研究必不可少的工具。它们广泛用于免疫分析技术，例如荧光WB，免疫荧光(IF)，多重荧光免疫组化（mIHC），流式细胞术(FC)等等，二抗金标准Jackson公司的荧光基团偶联二抗可以让您感兴趣的分析物变得可视化。荧光检测相对于比色或化学发光检测的主要优点是它能实现多重检测。无论您是检测单个靶标，还是正在进行复杂的多色研究，选择合适的荧光基团都非常重要。

1

什么是荧光基团？

荧光基团是一种吸收特定波长范围内的光(激发光)并发射另一个更长的波长范围的光(发射光)的分子。发生激发和发射的波长范围称为激发和发射光谱。对于每个荧光基团，存在一个最优波长，在该波长下荧光基团能最有效地被激发，这个波长被称为激发峰。同样，发射光谱也具有荧光信号最强烈的波长(发射峰)。激发和发射过程是循环的，只有当荧光基团受损(光漂白)时才结束。这种损伤通常是由于长时间暴露在激发光源下造成的。荧光基团的这种吸收和发射光的能力使它们可以用于各种研究技术。

AF488激发光和发射光示例

2

荧光基团如何用于科学研究?

荧光基团用于许多研究应用，最常用于免疫分析技术，如免疫荧光(IF)， 荧光Western blot，荧光ELISA (FLISA)，免疫细胞化学(ICC)，多重荧光免疫组化（mIHC）和流式细胞术（FC）等等。二抗金标准Jackson公司的荧光基团偶联二抗用于结合识别待检测抗原的特异性一抗。使用荧光标记的二抗和直标一抗相比可以起到增强信号的作用，并且对一抗的选择限制性更少也使得在实验设计上也更加灵活。

3

有哪些常用的荧光基团?

常用的荧光基团，如异硫氰酸荧光素(FITC)，Rhodamine Red- X(RRX)，四甲基罗丹明(TRITC)和氨基甲基香豆素醋酸酯(AMCA)，Alexa Fluor，DyLight，Cyanine(Cy)和Brilliant Violet等。此外，荧光蛋白R-phycoerythrin (R-PE)、Allophycocyanin (APC)和Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP)也可用于特定的应用，如流式实验。荧光基团被不断扩充和设计以用来填补现有基团之间的光谱空白，以便于研究人员可以同时检测更多的指标。另一些则为了与光谱细胞术兼容，这种技术可同时检测40个以上的靶标。

按照发射波长分类：

常用的荧光基团系列介绍

（1）Alexa Fluor系列

Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料，后被Life technologies收购。该系列的各染料主要根据其激发光的最大波长（nm）命名。Alexa Fluor在基础荧光染料中引入磺酸酯基团，使染料呈负电性和亲水性，从而具有更好的光学稳定性，发光强度和PH适应性。它们是高度水溶性的，并且可以在pH 4到pH 10范围内保持荧光。

常用Alexa Fluor荧光基团的激发峰和发射峰值

GFAP (20334 DAKO), an astrocytic intermediate protein, donkey-anti-rabbit Alexa488 (711-545-152 Jackson ImmunoResearch).

（2）Brilliant Violet系列

二抗金标准Jackson公司和著名流式抗体生产商BD公司联合推出了Brilliant Violet荧光二抗产品。BV染料是一种由有机多聚物构成的新型染料，具有明亮的荧光信号，优越的分辨率和灵敏度，非常适用于低丰度抗原染色。Brilliant Violet是一种紫色激光激发的染料，比其他紫色激光激发的染料更加明亮。

常用Brilliant Violet荧光基团的激发峰和发射峰值

Anti-Ki67 visualized with BV 480 Goat Anti-Rabbit 111-685-144;Mouse Anti-Tubulinvisualized with BV 421 Goat Anti-Mouse 115-675-166，Jackson ImmunoResearch

（3）Cyanine系列

Cy (Cyanine) 系列染料也叫菁染料，即花青素系列荧光染料，是具有（CH）n链和两端含氮杂环的一类合成荧光染料。桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值，从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。在目前可用的荧光染料中，Cyanine染料耐受性优越，能够更好地耐受苛刻的脱水和包埋条件，并且可以支持DPX，Permount等非极性有机封片剂，是最适合做永久封固的荧光素染料。Cyanine染料在非极性和极性环境下都有很强的荧光，在非极性环境中比在水介质中更明亮。

常用Cyanine荧光基团的激发峰和发射峰值

GFAP and Connexin 43，visualized with Jackson ImmunoResearch secondary antibodies donkey-anti-mouse Alexa488 (715-546-150) and donkey-anti-rabbit Cy3 (711-165-152).

（4）荧光蛋白—R-PE，APC和PerCP

R-PE和APC是在红色、蓝绿色和隐单胞藻中发现的捕光藻胆蛋白。PerCP是从鞭毛藻中分离出来的一种多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物。R-PE, PerCP和APC可以在可见光范围内被激发，具有高度水溶性和相对较低的等电点，并且缺乏潜在的粘性碳水化合物。这些荧光蛋白相对较高的分子量可能会妨碍它们很好地渗透到细胞和组织中，主要用于流式细胞术细胞的表面标记。

R-PE，APC和PerCP的激发峰和发射峰值

常用荧光基团激发和发射峰值：

4

如何选择荧光基团?

在选择用于科学研究的荧光基团时，主要考虑荧光基团组合的设计。在用于多重检测实验时，选择彼此兼容的荧光基团组合以及检测和分析它们的仪器是至关重要的。

（1）建议使用明亮的荧光基团(如PE, Alexa Fluor®488)检测弱表达的靶标，而不太明亮的荧光基团(如FITC)可用于检测大量表达的靶标；

（2）考虑每个荧光基团的激发和发射光谱，最大限度地减少光谱重叠和避免背景干扰也很重要；根据仪器具有的激光激发波长和检测通道选择合适的荧光基团；

（3）另外选择光谱不与内源荧光重叠的荧光基团，检查未染色的标本以确定样品是否显示自身荧光。

（4）另一个策略是确认多个荧光二抗组合时产生的荧光信号与单个荧光抗体相同；这将排除由于不同抗体混合在一起而产生的交叉反应或阻断效应。可以用单个荧光抗体作为对照。

（5）另外，所有的荧光基团都应该妥善储存，远离光线。到保质期的试剂应该与新试剂一起测试，以确保亮度不受影响。一些荧光基团可能对常见的固定和渗透缓冲液敏感，在实验时应进行优化。某些荧光基团可能与某些细胞类型或结构非特异性结合，虽然封闭液可以防止这种情况，在和其他荧光基团一起使用时需要检查。

Jackson ImmunoResearch Inc.（JIR）是世界著名二抗生产商，致力于生产亲和纯化的二抗金标准品牌。

Jackson荧光二抗的优势：

1. 高灵敏度，线性范围广；

2. 高稀释比，性价比高；

3. 高特异性：10种特异性，包括IgG(H+L)、IgG Light Chain、IgG F(ab’)2、IgG VHH、IgG Fc、IgG + IgM、IgA + IgG + IgM、IgM、IgA和IgE；

4. 种属丰富：16种种属，包括小鼠、大鼠、人、兔、绵羊、羊驼、牛、猫、鸡、狗、山羊、绵羊、豚鼠、马、仓鼠、猪；

5. 标记丰富：从蓝光到近红外光谱范围（400 nm~1400 nm）内，涵盖了19种不同的荧光标记染料，分辨率高并且仪器兼容性广；

6. 稳定性好：亲和纯化二抗，光耐受性（抗淬灭性）强，水溶性好，储存不会产生沉淀，pH值不敏感；

7. 可消除物种之间的交叉反应：Jackson提供超2000种的预吸附二抗，可以最大程度地消除了特点物种之间交叉反应，适合用于多标记的IF/IHC/ICC实验，并可获得更低的背景值。（产品名称min X后的物种已验证过不会交叉反应）。

部分相关产品：