腺病毒的下游纯化方案

转自：楚天人

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细胞与基因治疗（Cell and Gene Therapy,CGT）是一种通过基因表达、沉默或体外改造手段，在蛋白质水平进行调控的疗法。基因载体的体内递送目前常见的基因载体分为非病毒载体和病毒载体。非病毒载体包括质粒或裸露DNA（非病毒）、LNP递送系统等，但体内转染效果差、毒性大，严重制约了非病毒载体的临床转化。病毒载体则包括常用的腺病毒AdV、腺相关病毒AAV、慢病毒LV和逆转录病毒RV等载体，今天我们要讨论的就是病毒载体腺病毒的纯化相关知识。

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什么是腺病毒

Technology _ 

腺病毒(adenovirus，AdV)是一种没有包膜的线性双链DNA病毒，颗粒直径大约为70-90nm，由240个六邻体和12个五邻体组成，五邻体和纤毛的头部顶球结构域可与细胞表面的受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。

腺病毒载体宿主细胞范围广泛，有效感染分裂细胞和非分裂细胞，不与宿主细胞基因组整合，因而不存在插入突变风险，载体容量较大。

其外壳的主要组成部分Hexton蛋白在中性条件下带有负电，因此病毒颗粒表面带有大量的负电荷，使得阴离子交换层析成为捕获步骤的首选。然而不同血清型的腺病毒其外壳蛋白不同，相应的下游纯化工艺也需要做精细调整。

未纯化的病毒载体中含有细胞碎片、培养基等杂质，这些杂质如果被注入动物体内，会引起宿主的免疫反应，所以制备腺病毒载体时非常关键的一步就是对其进行纯化。

腺病毒纯化工艺

Technology _ 

腺病毒的纯化步骤通常包括细胞裂解、澄清、核酸酶处理、浓缩换液、捕获层析、精纯层析、除菌过滤等步骤。

1、细胞分离：腺病毒培养过程中部分腺病毒分泌到培养基中，部分在细胞中。使用离心或中空纤维将培养基上清和细胞分离，细胞采用冻融的方法裂解或去污剂Triton X-100（浓度通常1%）。加入Benzonase酶切断染色体DNA，降低样品粘度。

2、澄清：使用中空纤维或离心去除细胞碎片及其他颗粒杂质，得到澄清的病毒液。

3、浓缩换液：浓缩更换缓冲液，将培养上清（如果上清中的病毒颗粒较多，舍弃会影响收率）与澄清后的样品混合，使用中空纤维浓缩，更换为离子交换的缓冲液，为后续的层析做准备。

4、捕获：腺病毒的层析纯化中，由于病毒颗粒表面带有大量的负电荷，第一步通常使用强阴离子交换的Q填料来对腺病毒进行捕获，采用NaCl洗脱，通常腺病毒在0.4-0.6M NaCl浓度时被洗脱下来，洗脱后腺病毒在高盐缓冲液中。

5、精纯：精纯时通常会选用4FF凝胶过滤来进行纯化，将残留的小分子杂质全部去除，上样一般在5-10%，同时起到更换缓冲液的作用。当然也可以选用有和4FF填料一样孔径的分子筛功能的复合型填料来精纯，可以更进一步提高此步的纯化效率。

6、制剂：精纯得到符合纯度要求的腺病毒液后，即可对病毒液进行制剂。

7、除菌过滤：最后再进行一步除菌过滤，即可做成符合标准的腺病毒制剂。

楚天微球TA-Q XL和TA-4FF优势

Technology _ 

楚天微球TA XL系列介质是在高度交联的琼脂糖基架上先偶联线性葡聚糖分子，再在葡聚糖分子上偶联各种功能基团，这种结构减少了生物分子之间的位阻效应，能大大提高对目的物分子的载量。TA-Q XL为强阴离子交换介质，可以直接从料液中捕获病毒等生物大分子，不仅载量高，还易于进行大规模生产放大。

楚天微球TA- 4FF（Fast Flow）为4%的琼脂糖经过乳化、漂洗、多次交联、分筛而成的凝胶过滤介质，用于多糖、核酸、病毒等生物大分子的分离纯化或者检测，该介质也经常作为亲和、疏水、离子交换层析的基架。TA-4FF是在TA-4B的凝胶基础上用2,3-二溴丙醇多次交联而成的，交联程度比TA-CL 4B高，物理化学性能更稳定，该类介质可以耐受120°C高压灭菌，流速快，适合在大规模分离纯化中应用。