干货丨cDNA不盲投，一文理清qPCR模板投入的基本操作

转自：诺唯赞生物

qPCR实验作为常见的分子检测手段已经被广泛使用，但小小的qPCR实验却有大大的学问，一个细节的不小心都有可能导致实验的失败！

今天要和大家分享的实验细节是关于qPCR实验中模板的投入问题，那大家在平时是如何判断cDNA稀释倍数呢？又是怎么计算cDNA的加入体积呢？是否了解投模板时怎么做才能减少误差和错加漏加呢？带着这些疑问让我们一起来了解一下qPCR模板投入的基本操作吧！

1. 如何确定cDNA的稀释梯度及投入量

方法一

将cDNA做梯度稀释，把得到的不同梯度cDNA同时进行qPCR，选择位于15-33范围内的CT值对应的cDNA稀释梯度作为最佳稀释梯度。如下图所示。（经验值认为，目的基因CT值建议在15-33内，内参CT值建议在15-25内）

举个例子：

如要扩增某处理组 GAPDH 内参基因，将逆转得到的cDNA进行10倍梯度稀释，得到的cDNA浓度梯度分别为：100（原液）、10-1、10-2、10-3、10-4，将5个cDNA模板同时上机做qPCR，得到的CT值分别为：13、16.3、19.6、22.9，26.2。所以后续再扩增该处理组 GAPDH，就可以选择10-1、10-2、10-3梯度进行扩增。

方法二

若拿到一个之前没有做过的体系，不知道其拷贝数高低时，可以先选择cDNA原液进行qPCR并得到CT值。根据2△CT=浓度差公式可知，模板每稀释10倍，则CT值扩大3.3个循环左右，可以按照此规律大致判断CT值大小，调整最佳cDNA稀释倍数。

举个例子：

某处理组 GAPDH 内参基因，cDNA原液上样1 μl，得到的CT值为10。要想使该处理组 GAPDH 内参基因的CT值为16左右，仅需在cDNA原液的基础上稀释100倍即可使该处理组 GAPDH 内参基因的CT值达到16左右。

注意：

✦不同的体系（基因）、同一基因不同的处理组都需要进行最佳cDNA稀释梯度的验证，保证所有的体系的CT值都落在15-33范围内，可以有效避免因cDNA稀释梯度不准确导致CT值过小或过大，甚至无CT值的情况。

✦cDNA原液的添加体积不能超出qPCR反应体系的1/10，如20 μl qPCR反应体系，cDNA原液最多只能上2 μl，超出1/10体系，会对qPCR反应产生抑制作用。

2. 如何避免投模板时误差和错加漏加

一、采取大体积配制试剂，预混Mix溶液，避免小体积加样误差导致各反应孔反应成分不均；

二、使用有颜色的逆转录和定量试剂，可以起到移液可视化的作用，防止样本太多导致的错加漏加。

举个例子：

实验体系配制（以Vazyme #Q312推荐加样体系为例，检测1个内参基因、1个目的基因，2组样本包括对照组和处理组）：

Mix 1：qPCR Mix + 引物（共9孔）

Mix 2：水 + cDNA模板（共6孔）

注：①一般会多配一些样品，这样保证最后每个孔都能有同等体积的液体；预混后要涡旋离心，使其混匀！     

② Q312为通用型试剂，无需在不同仪器上调整ROX的浓度。若所用试剂为非ROX预混型试剂，且仪器需要ROX进行校正（如ABI stepone），需要在加样时注意添加ROX。

加样效果展示：

注：图为cDNA原液的加样效果，若cDNA进行了稀释，颜色可能会变浅。

如果您有任何疑问，欢迎联系您身边的诺唯赞人，我们将持续为您提供更优质的产品与服务！如果您有任何需求都可致电：400-600-9335！