转自：诺泰生物
引 言
冠心病是临床常见的循环系统疾病，其发病率呈逐年上升的趋势。经皮冠动脉介入术（percutaneous coronary intervention，PCI）是治疗冠心病的主要方法之一，治疗过程中抗凝药的选择至关重要。肝素是心血管手术的首选抗凝剂，但有可能造成肝素诱导性血小板减少症（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）和肝素抗体阳性等副作用[1]。
比伐芦定（bivalirudin）是一种新型的直接凝血酶抑制剂（direct thrombin inhibitor，DTI），是根据水蛭素的蛋白序列设计、合成的20肽水蛭素类似物。最早由Biogen开发，后授权给美国The Medicine Company，2000年12月在美国FDA获批上市，2004年9月在欧洲EMA获批上市，2019年2月在中国NMPA获批上市。
比伐芦定通过抑制凝血酶的活性发挥抗凝作用，该抑制作用具有可逆性、短暂性和特异性等特点。比伐芦定可应用于成人PCI的抗凝，预防不稳定心绞痛、缺血性并发症。与普通肝素相比，比伐芦定不需要依赖抗凝血酶就能起到抗凝作用，不需要血液检测，半衰期较短，抗凝效果显著优于普通肝素，同时降低不良出血事件及心血管事件的发生率，预后更佳[2]。
水蛭素的结构与抗凝血机制
水蛭又称蚂蟥，是颚蛭目水蛭科环节动物的统称，分布于世界各地，生活在稻田、沟渠等浅水中，嗜吸人畜血液。在西方使用蚂蟥进行放血疗法可以追溯到古希腊时期，并沿用至19世纪。1884年，英国人John Berry Haycraft发现医用的水蛭在吸血时会分泌抗凝血的物质在宿主的皮肤切口。1904年左右，德国科学家从水蛭头部提取到了抗凝血活性组分，并建议命名为水蛭素（Hirudin，衍生自水蛭的拉丁语名Hirudo）。直到20世纪50年代，得益于蛋白质化学的发展，德国药学家Fritz Markwardt成功地分离提纯了水蛭素，并初步确认为含有65个氨基酸残基的多肽链，分子量约为7000。在1976年，最终解析得到了水蛭素的完整一级结构（如图1所示）[3]。
图1 水蛭素的氨基酸序列（其中酸性氨基酸残基用红色标记，碱性氨基酸残基用蓝色标记，半胱氨酸残基用金黄色标记）
天然的水蛭素是一条含65个氨基酸残基的单链多肽，其靠近N端部分有三对二硫键（Cys6-Cys14，Cys16-Cys28，Cys22-Cys39），使肽链绕叠形成紧密的疏水环肽结构，其C-端有多个酸性氨基酸残基（包括硫酸化的Tyr63）[4]。肽链中部还有一个由Pro-Lys-Pro组成的特殊序列起稳定作用。
图2 凝血级联反应示意图
凝血酶（thrombin）是血液凝固和止血过程中的中心酶（如图2所示）[1]，一方面凝血酶使纤维蛋白原（凝血因子I）转变为纤维蛋白，另一方面还能激活其他的凝固血液的酶，如凝血因子V、VIII、XIII和抗凝血酶蛋白C等。如图3所示，凝血酶涉及凝血反应的功能区至少有三个：活性位点（active site）或催化位点（catalytic site），能够与纤维蛋白原结合并催化其转化为纤维蛋白的特定区域；纤维蛋白原结合位点（exosite 1），带正电荷，在纤维蛋白原接近活性位点时提供静电导向，识别纤维蛋白原、凝血酶受体等底物中带有负电荷的区域；肝素结合位点（exosite 2），同样带正电荷，是与肝素、氨基葡聚糖等多阴离子配体相互作用的区域。
图3 凝血酶的三维结构（两个外结合位点用橘黄色标记，活性位点用蓝色标记）[5]
图4 凝血酶与水蛭素的结合模型
凝血酶与水蛭素的结合模型如图4所示[6]，水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位点，其疏水结构域与凝血酶的非极性结合位点互补，该非极性结合位点靠近凝血酶的催化中心。水蛭素末端有6个酸性氨基酸，能与带正电的纤维蛋白原结合位点形成许多离子键。N端、C端两个功能域以协同的方式结合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一顶“帽子”，从而抑制凝血酶与纤维蛋白原的相互作用。水蛭素N端与C端功能域之间存在一个指状结构，不与凝血酶分子接触，属于功能非必需区，不参与凝血酶的抑制作用。
比伐芦定的分子设计
图5 水蛭素与类似物地西卢定、来匹卢定的结构比对
从水蛭中直接提取的水蛭素，因其来源有限，价格昂贵，且因杂质的存在易造成出血并发症、过敏等副作用，限制了其临床应用与进一步开发。用重组的方法得到足够多的水蛭素或类似物成为了更可行的途径。Novartis开发了地西卢定（desirudin），Schering-Berlex则开发了来匹卢定（lepirudin），两者的结构见图5。来匹卢定是第一个被批准用于临床的凝血酶抑制剂，其能够对肝素诱导引发的血小板减少症并发形成血栓起到治疗作用。两者63位的Tyr残基均无硫酸化，以致两者对凝血酶的亲和力比天然水蛭素降低10倍，但仍是很强的凝血酶抑制剂。
为了更好地了解水蛭素结构与性能的影响，人们对水蛭素的N端、C端和其他位点做了大量的研究，为设计结构类似的衍生物打下了坚实的理论基础。上文也提到，从凝血酶与水蛭素的结合形态可知，两个功能域之间还存在一段功能非必需区，这给简化分子结构提供了可能性。构效关系的研究表明[7]，水蛭素C端的10个氨基酸残基（Asp55至Leu64）是保持活性的最小结构，C端的最佳大小至少是12个氨基酸残基，在这一序列中每个氨基酸残基都对活性很重要。
图6 比伐芦定分子设计中合成的典型水蛭素类似物结构
基于构效关系研究，设计了大量简化的多肽分子，图6列出了比伐芦定开发过程中典型备选分子的结构[8]。最终设计得到的分子由三部分组成，即N端与凝血酶催化活性位点特异识别的序列、C端与纤维蛋白原结合位点的序列和两者之间的功能连接桥。使用D-Phe-Pro-Arg-Pro序列直接作为N端（Hirulog-1），如果用L-Phe取代N端D-Phe（Hirulog-4），抗凝血酶活性将大幅度降低，当N端四肽完全去除时（(Gly)5-Hir53-64），几乎检测不到对凝血酶的抑制活性。中间连续Gly序列的长短对活性的影响也进行了研究，当只有2个Gly残基时（Hirulog-2），活性大幅度下降，而4个、6个甚至8个Gly残基组成的不同分子活性基本没有太大的差异，只起到了柔性连接的功能。值得一提的是，比伐芦定分子N端四肽的结构可被凝血酶水解，水解后比伐芦定丧失抗凝血活性，使凝血酶活性回复，因此比伐芦定对凝血酶的抑制活性是可逆性的。比伐芦定与凝血酶的结合模型与失活机理详见图7。
图7 比伐芦定与凝血酶的结合模型与失活机理
后 记
在过去的半个多世纪中，天然产物分子在医药产业发展中体现了巨大的价值。天然产物分子及其类似物的化学合成在药物分子的发掘和发展中扮演了重要的角色。合成化学手段不但能够进一步验证天然产物分子结构，建立相应的构效关系模型，并且使得进一步优化、衍生基于天然产物分子先导化合物的策略成为了可能。通过合成化学手段可以获得多种天然产物类似物，和相关的构效关系研究，是药物研发的先决条件。从天然来源水蛭素分子结构的鉴定，到水蛭素与凝血酶结合模型的提出，最终开发出可人工大规模合成的药物分子比伐芦定，为基于天然的蛋白/多肽分子，设计高效、安全的药用多肽分子，树立了一个成功的典范，给本领域研究人员以启迪。
编者按：2023年6月12日，江苏诺泰澳赛诺生物制药股份有限公司（简称“诺泰生物”）收到了国家药品监督管理局签发的注射用比伐芦定《药品注册证书》。注射用比伐芦定是公司自主研发的第5个获批的制剂产品。诺泰生物是国内通过或视同通过注射用比伐芦定一致性评价的药品上市许可持有人之一。此次注射用比伐芦定的获批，标志着公司具备了在中国销售注射用比伐芦定的资格，同时进一步丰富了公司的制剂产品线。
参考文献
[1] Askari A, Lincoff M, Messerli A. Management Strategies in Antithrombotic Therapy[J]. 2008.
[2] Shah R, Rogers K C, Matin K, et al. An updated comprehensive meta-analysis of bivalirudin vs heparin use in primary percutaneous coronary intervention[J]. American Heart Journal, 2016, 171(1): 14-24.
[3] Markwardt F. The development of hirudin as an antithrombotic drug[J]. Thrombosis research, 1994, 74(1): 1-23.
[4] Dolt J, Seemuller U, Maschler R. The complete covalent structure of hirudin[J]. Biol Hoppe Seyler, 1985, 366: 379-385.
[5] Pica A, Russo Krauss I, Parente V, et al. Through-bond effects in the ternary complexes of thrombin sandwiched by two DNA aptamers[J]. Nucleic acids research, 2017, 45(1): 461-469.
[6] Warkentin T E. Bivalent direct thrombin inhibitors: hirudin and bivalirudin[J]. Best Practice & Research Clinical Haematology, 2004, 17(1): 105-125.
[7] Maraganore J M, Chao B, Joseph M L, et al. Anticoagulant activity of synthetic hirudin peptides[J]. Journal of Biological Chemistry, 1989, 264(15): 8692-8698.
[8] Maraganore J M, Bourdon P, Jablonski J, et al. Design and characterization of hirulogs: a novel class of bivalent peptide inhibitors of thrombin[J]. Biochemistry, 1990, 29(30): 7095-7101.
供稿人：Dr. Jonathan
