转自：药通社
欧盟在2019年发布了《药品、活性物质、辅料和内包材灭菌指南》。其中，关于蒸汽（湿热）灭菌一节，EMA列出了一个表格，对于不同灭菌程序有不同的资料要求。
表1
有关代码的说明，如下：
** In-process control demonstrating acceptable heat resistance of bioburden
中间控制证明了生物负载的耐热性较低
*** The bioburden prior to the sterilisation step (i.e. filtration) should be characterised for heat resistance
灭菌步骤（即过滤）之前的生物负载具有耐热性的特征
**** Temperatures below 110 ℃ may be used if justified. The requirement for additional documentation for such cycles is evaluated on a case by case basis
如果合理，可以使用低于110℃的温度。根据具体情况评估对此类程序的额外文件要求
Clarification of the information to be presented in the quality dossier
质量档案中需提供的信息
1: Sterilisation time, temperature profile
1：灭菌时间，温度曲线
2: Sterilisation method (for instance saturated steam cycle, air/steam-overpressure cycle, vacuum phase) description including SAL12
2：灭菌方法（例如饱和蒸汽循环，空气/蒸汽–过压循环，真空阶段）描述，包括 SAL
3: Validation of F0Phys and F0Bio
3：F0Phys和 F0Bio验证
4: Biological indicator with a D121 ≥ 1.5 minutes used in the validation
4：生物指示剂 D121≥1.5 分钟用于验证
5: Biological indicator with a D121 < 1.5 minutes used in the validation
5：生物指示剂 D121 <1.5 分钟用于验证
6: No validation data requested in the dossier, only a confirmation that validation has been performed.
6：档案中无需提供验证数据，仅确认已执行验证。
7: Validation data to be provided in the dossier is presented below
7：档案中提供的验证数据（后附）
8: Additional validation data to be provided in the dossier is presented below
8：档案中提供的（除7外）附加验证数据（后附）
一眼看上去有些不明所以，我们将其整理一下，形成如下表格：
表2
看了这个资料要求，我们会很自然地问出几个问题：
（1）为什么选择121℃、15min的灭菌条件就不需要提供灭菌验证资料了？
（2）为什么过度杀灭法（121℃、12min）必须选择D121≥1.5 分钟的生物指示剂？
（3）为什么欧盟建议的最低灭菌温度是110℃？
（4）在其他灭菌条件中，有时选择D121≥1.5 分钟的生物指示剂，有时选择D121<1.5分钟的生物指示剂，依据是什么？
应该说，欧盟的无菌指南的要求非常的细致，任何一种情形都能在表格中找到对应的要求。我们很容易知道怎么做（How），但若想要自己的思维得到升华，就需要解答这几个问题，从知道怎么做（How），到理解为什么这样做（Why）。
（1）为什么选择121℃、15min的灭菌条件就不需要提供灭菌验证资料了？
首先要了解121℃、15min灭菌条件的意义。我们知道，过度杀灭法是假设微生物负荷最差（106CFU）情况下，来确定使被灭菌品（假设D121=1分钟）达到微生物存活概率10-6的杀灭时间。121℃灭菌1min，D121=1分钟的微生物降低一个数量级，因此灭菌12min可以让微生物负荷106的样品微生物存活概率达到10-6。
而121℃、15min的来源是半周期法。半周期是在灭菌柜冷点的位置放置了初始细菌计数为106CFU的生物指示剂，其灭菌时间是所有生物指示剂死亡时间的两倍。在过度杀灭法中，灭菌时间为12min，而在半周期法中，灭菌时间为14min至16min。初始细菌计数为106CFU的生物指示剂的存活概率在7 min时为10％，在8 min时为1％，因此（7 min至8min）× 2=14min至16min。而14min至16min的平均值即为15min。
可以看到，虽然只是灭菌时间差了3min，但两者代表的意义并不一样。显然，半周期法的121℃、15min相比于过度杀灭法，是一种更加矫枉过正的灭菌条件。在这样的灭菌条件下，EMA认为产品的无菌已经得到了足够的保证，因此不再要求申请人提供灭菌验证资料。
（2）为什么过度杀灭法（121℃、12min）必须选择D121≥1.5 分钟的生物指示剂？
在灭菌验证中，需要验证物理杀灭时间（F0Phys）和生物杀灭时间（F0Bio）的一致性。由于121℃、12min的F0Phys>12，则要求F0Bio也大于12。
根据公式F0Bio=（LgN0-LgNF）×D121。其中，F0Bio带入12，NF按规定数值为100，D121如果按照要求的最低值1.5带入，则12=（LgN0-0）×1.5。计算可得N0=108。即如果使用D121=1.5分钟的生物指示剂，那为了达到灭菌验证要求，该指示剂的孢子数应该至少达到108。如果使用D121更小的生物指示剂，那所需的孢子数更会需要几何级数的上升，这显然是很难做到的。
（3）为什么欧盟建议的最低灭菌温度是110℃？
这就涉及到了一个灭菌率的概念。 灭菌率是指某一温度T（℃）下灭菌1min所获取的标准灭菌时间（121℃下的灭菌时间）。L(T,Z)=10(T-Tref)/Z，Tref指标准灭菌温度（121℃）。例如：在Z=10℃的指示系统，温度120℃灭菌1min，计算灭菌率L=0.79，相当于121℃下灭菌0.79min。温度122℃灭菌1min，计算灭菌率L=1.26，相当于121℃下灭菌1.26min。可见很小的温度变化就会对灭菌率产生明显的影响。如果是110℃灭菌，带入公式计算，灭菌率L=0.08。也就是说，在110℃条件下，灭菌率已经不到标准灭菌温度（121℃）的十分之一了，需要灭菌100分钟，才能使F0>8。继续降低温度，灭菌时长可能会延长到不合理的程度。
明白了灭菌率的概念，我们又会产生一个新问题。既然温度越高，灭菌率越高，那为何不把灭菌温度进一步提高，然后缩短灭菌时长呢？比如，灭菌温度提高到131℃，那只要维持1分钟，F0就达到了13，符合过度杀灭的要求了。但事实上，灭菌柜内的温度不可能在一瞬间从室温跳到131℃，需要一个升温的过程，在升温过程中，F0也在不断地累计。一般的灭菌柜从110℃升到121℃需要约3min，假设从121℃升到131℃也需要3min（事实上时间会更长，因为需要的热量更多），我们做个假设，每分钟升高3℃，简单计算一下在这个阶段累积的F0值。
可以看到，即使做了比较好的假设（升温速度够快，降温阶段忽略不计），想要做到131℃，1min的灭菌，累计的F0值也在24以上，足足达到两倍过度杀灭法的要求。而如果是121℃灭菌，升温阶段累积的F0值可能只在1左右。
可见，121℃的灭菌温度，是人们经过长期实践，摸索出来的性价比最高的参数。
（4）在其他灭菌条件中，有时选择D121≥1.5 分钟的生物指示剂，有时选择D121<1.5 分钟的生物指示剂，依据是什么？
将表1的第3行和第4行，第5行和第6行做比较，可以看出来，选择生物指示剂的D值只和微生物的菌种鉴定结果有关。如果灭菌前产品不存在耐热菌，比方说最强耐热菌的D值为0.2分钟。根据公示FBIO=（LgN0-LgNF）×D121℃。将FBIO=8，N0=106，NF=100，带入计算，则D121℃=1.33。即灭菌F0值在8以上，只要微生物负载的D121℃在1.33以下可以保证无菌保证水平SAL<10-6。实际本例中最强耐热菌的D值为0.2分钟，即使需要打出一定的富余量，选择D值为0.5分钟的生物指示剂，也足以保证验证的有效性。
反之，当不确定灭菌前产品菌种耐热性时，就应该选择D值更大的生物指示剂了。
有意思的第7行和第8行的比较，在F0<8，微生物负载有较强耐热性，灭菌温度≥110℃这些条件都一致的情况下，生物指示剂的选择反而自由了。既可以选择D121≥1.5 分钟，也可以选择D121<1.5分钟的。这其实和灭菌验证的不同设计方式有关。用一个灭菌程序121℃，6min，耐热菌种D值为0.8的品种来举例。可以使用D121=1的生物指示剂，将 N0=106，NF=100，D121℃=1带入公式FBIO=（LgN0-LgNF）×D121℃计算，则FBIO=6。FBIO与FPHY一致，符合验证要求。也可选择D121=2的生物指示剂。因为验证要求将FBIO≥8，将N0=106，D121℃=2带入公式FBIO=（LgN0-LgNF）×D121℃。则LgNF=3，即NF=103。也就是说，当灭菌后生物指示剂剩余的孢子数小于1×103CFU，即可认为灭菌验证成功。
人对事物的理解常常不是渐进性的，而是类似于某种进化性质的跳跃。事情常得靠自己实际走一遍。要先认真对某样事物投入，从投入的回馈中反思、阅读、学习、理解、反省。这样辛劳的过程经历一大段后，才会有一些心得性的东西。但有意思的是，这时候把自己的体会写出来，往往会发现毫无亮点，似乎就是从小就看过百变的道理。就像这篇文章一样，写出来却又觉得哪个地方都似曾在那个法规或技术指南里见过。但我还是尽可能用不同的角度去阐述灭菌验证这个事情，如果能在某时某刻能帮助某些人带来某种进化性质的跳跃，那会是非常快乐的事。
