转自：楚天人
近年来随着基因/细胞治疗的突破以及mRNA疫苗的火热问世，对质粒的需求和大规模生产的要求愈发迫切，因此质粒的规模化生产显得尤为重要。质粒DNA通常是在上游生物工艺中由大肠杆菌在发酵系统中生产，一般支持病毒载体和mRNA疫苗制造的质粒生产规模都在几十升至上百升，进行高密度发酵，对发酵生产设备要求较高。大肠杆菌发酵密度高，需氧量大，对发酵培养系统的溶氧和传质能力提出了更高的系统性要求，包括关联重要配置搅拌能力、通气能力、系统自控能力等都要求颇高。虽然小规模微生物发酵有报道可以采用一次性发酵系统，但由于发酵条件要求，通常及大规模发酵采用不锈钢发酵系统仍是目前业界金标准。不锈钢发酵系统强度高，可以实现更高的转速，更大的罐压，更大的通气量，从而拥有更高的氧传质效率，在优化工艺及高性能设计的设备系统中，某些工艺应用能够实现无需纯氧的情况下保证发酵后期工艺生产微生物对氧气的需求，从而简化生产工艺，更好地实现培养工艺稳定性。
本文使用楚天科技生物工程不锈钢反应器发酵系统进行了质粒的规模化发酵研究，进行两种质粒的中试/生产级别发酵生产，优化高密度细胞高产质粒的发酵工艺，检验反应器系统设计及控制性能对发酵工艺的保障能力。
在本研究中使用生产约6kbp P1质粒的大肠杆菌DH5α菌株和约3kbp P2质粒的大肠杆菌DH5α菌株，优化和总结了质粒工程菌株在5 L玻璃反应器发酵系统中质粒生产工艺和生产结果，并在不锈钢反应器发酵系统中进行50 L放大生产。研究结果显示大肠杆菌OD600、质粒含量关键发酵指标在小试研究和生产体系下均具有可比性和一致性。表明该生产型不锈钢反应器发酵系统在优化工艺下，对于不同性质质粒的宿主菌株高密度发酵的突出优势，完全有利于质粒制备的规模化生产需求。
在5 L玻璃发酵系统中接种既定OD600的种子，初始培养体积为2.0 L。接种后，DO值下降至设定值，然后搅拌速度和空气流量等通过预设级联控制自动供应到发酵系统。待溶氧开始回升，初始投料速率设定为0.1mL/min，并每小时增加10%至20%。发酵中后期将细菌比生长速率（μ）保持在0.03至0.15h-1。发酵过程增长曲线如下图所示。在培养过程结束时，P1质粒OD600峰值达到105.5，P2质粒OD600峰值达到107.78。
用提取试剂盒提取发酵液质粒后用分光度法测得质粒的含量。P1质粒含量达到576mg/L和P2质粒含量达到585mg/L。
在50L中试/生产发酵系统进行质粒放大生产，发酵工艺控制基本保持与5 L生物反应器相似的气体体积（VVM），且峰值VVM控制在2至3。在既定的OD600下接种至发酵系统，初始培养体积为20 L。DO为设定值，并级联到转速和空气流量。开始通过提高搅拌速度以保持溶氧，当达到最大转速再增大通气量。在发酵十多小时后，溶氧突然回升，并伴随着转速降低表示养分耗尽。此时以1ml/min开始补料，并每小时增加10%至20%，发酵中后期特定生长速率保持在0.03至0.15 h -1 。
发酵过程完成后，通过用提取试剂盒提取发酵液质粒后用分光度法测得质粒的含量。P1质粒含量达到528 mg/L和P2质粒含量达到543 mg/L。
在整个生产过程中，根据培养工艺，包括搅拌速度和通气速度等过程控制均采取反应器自控系统自动化控制。在培养批次中，DO级联空气流速和搅拌速度，整个发酵培养工艺过程无需纯氧通入，即可保障菌体高密度发酵溶氧设定需求，从而使生产工艺得到简化，并能降低生产成本和提高工艺保障。
补料速率可通过控制软件的自动程序预设值自动调整，简化操作。所有补料速率和补料重量数据都记录在控制软件中，减少了操作错误的风险，更好地满足了监管要求。
发酵系统关键运行参数曲线如上图所示。关键参数：DO（红紫色线）、pH（浅绿色线）和温度（浅黄色线）在整个培养过程中保持平稳，波动轻微。工艺过程监控表明50L中试/生产反应器发酵系统可对所有关键参数进行良好控制，保障工艺过程稳定和发酵结果优良。
在50L中试/生产反应器发酵系统中，OD600峰值超过120，意味着此生产系统可以支持高OD600值高密度大肠杆菌的发酵生长。从5升玻璃反应器放大到50升反应器发酵系统，可得到相当的OD600峰值和质粒含量，这意味着50L反应器发酵系统能保障放大生产过程，大肠杆菌获得良好的生长和质粒生产。
根据工艺需要，楚天科技生物工程中试/生产不锈钢反应器发酵系统，可采用三级叶轮组合，以根据工艺和设计需要提供较高的培养混合性能及传质效率。六叶Rushton叶轮，可为系统提供出色的动力；轴向式叶轮，增加气体滞留时间；最上层为消泡桨。系统配备三个可拆卸的挡板，可极大地加快传质速度。
本文研究采用发酵系统采用大量程的空气和氧气质量流量控制器，足够的通气量满足微生物生长的氧气需求；不锈钢系统强度高，采用高转速的搅拌系统，能极大地保证传质速度，保证氧气能快速溶解到培养基中；不锈钢发酵系统耐压能力高，最高可以达到2.5bar，较大的罐压，可以增大氧气在培养基中的溶解度，进一步保证微生物生长对氧气的需求；自控系统软件配置支持各种气体控制方案，包括典型三阶段级联控制：第 1 阶段转速，第 2 阶段空气流量，第 3 阶段氧气流量，以应对不同培养工艺对于溶氧的需求。
COE
楚天科技 生物制药中心COE
楚天科技生物制药中心，简称“卓越中心” COE （Centre of Excellence）。COE着力于生物制药工艺开发及放大，工艺技术咨询服务，制药设备新产品研发、测试及验证，能够承担与制药企业、科研院所对接研发平台。旨在为全球生物医药客户解决工艺开发和生产方面的关键挑战。
COE配备先进的工艺开发及中试设备，并拥有多位深耕生物制药行业多年的工艺技术专家的专业团队，可以帮助企业客户进行技术咨询、工艺开发、产品使用培训及问题解决，促进生物医药项目的快速推进和转化。COE拥有小试工艺实验室、分析测试平台、一次性平台工艺、生物制药中试平台、制药工艺方案规划等技术平台，旨在为抗体、疫苗、基因与细胞治疗、重组蛋白药物、核酸药物、血液制品等多个生物制药领域提供从研发到生产整体解决方案。
楚天科技 生物反应器产品线
楚天科技旗下生物反应器产品线经过多年研发设计应用以及持续的研发投入，构建了完整的生物反应器产品平台，包括台式桌面小型玻璃生物反应器/发酵罐、中试生物反应器/发酵罐系统和大规模生产型生物反应器/发酵罐全系列产品，可提供从实验室到商业规模的一站式整体解决方案，满足用户细胞培养、微生物发酵工艺研发和商业生产的需求，提供最符合项目目标的高质量设备产品和生物培养工艺方案。
