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二
连接两通，建立MRM方法
定量工作一般采用MRM 模式，对于目标化合物首先需要建立化合物的MRM 分析方法。
1）Q1/Q3 扫描
（1）配制一定浓度（例如1000 μg/L）的目标化合物单标或者混标，通过自动进样器进样，进样体积1 μL。Q1/Q3 同时扫描正负离子的目标前体离子，可正负离子同时扫描。
“Start m/z（测定开始m/z）”和“End m/z（测定结束m/z）”：根据目标化合物的分子量自行设置合适范围。
“Acq. Time（测定时间）” “Data Acquisition（数据采集时间）”一致，均修改为0.5 min
“Pump（泵）”部分选择“Binary gradient（二元高压）”，“Total Flow（总流速）”0.4 mL/min，“Pump B Conc.（泵B 浓度）”有机相80%
“Column Oven（柱温箱）”前的“√”去掉
“Autosampler（自动进样器）”将Rinse Type（清洗类型）改为“External Only（清洗针外壁）”
以上条件设置完成，保存方法，单击快捷键“
”，然后按“Download”键。
单针/批处理进样分析。
（2）数据结果查看
打开Postrun（再解析）窗口，打开数据文件，使用“Average Spectrum（谱图平均）”工具，查看某段时间内的平均质谱图，找到目标化合物的[M+H]+或者[M-H]-及加合离子信息，根据分析结果选择合适的前体离子。
2）利用产物离子自动搜索的方式优化
（1）单击“Optimization for Method（优化方法）”，弹出的对话框中选择“Optimize MRM event from product ion（利用产物离子搜索进行优化）”作为优化方式。在弹出的对话框中，依次输入“Compound Name（化合物名称）”、“Precursor m/z（前体m/z）”、“Start(min)（开始（min））”0min、“End(min)（结束（min））” 0.5 min、“Vial（样品瓶）”、“Tray（样品瓶架）”、“Inj Vol.（进样体积）” 1.0 μL等信息。鼠标左键点击“Start（开始）”，开始MRM 优化过程。
（2）利用产物离子搜索完成一个化合物的MRM 优化需要4步，通常2分钟内可以完成一个化合物的优化，若时间过长，建议Stop 整个优化过程，检查End (min)是否修改为0.5 min（默认为10 min）。
三
连接色谱柱，建立液质方法
1）加载MRM方法
将“二”优化好的MRM 参数加载到新建方法中。找到MRM 方法文件所在的文件夹，选中所有需要的MRM 方法文件。修改“Acq. Time（测定时间）”为分析一个样品所需的时间，例如0-10 min。
2）建立色谱分离条件
常用的有机相包括甲醇和乙腈，甲醇作为质子化溶剂（氢键供给者）洗脱能力较弱、粘度较、高，乙腈反之。醋酸/乙酸铵、甲酸/甲酸铵、氨水为常见的流动相PH调节剂。在初步确定的液相方法适宜pH值与溶剂条件后，我们将筛选不同色谱柱的分离效果、优化流动相梯度、调节柱温箱温度等。
（1）液相梯度条件设置
液相色谱的初始条件在Pump（泵）选项卡中依次设置：二元高压系统选择“Binary gradient（二元高压梯度）”，设置“Total Flow（总流速）”、初始浓度“Pump B Conc.（泵B 浓度）” 如果采用线性梯度则默认0、最高压力限“Maximum”设置为100。Pump（泵）选项卡设置后，在梯度表格中设置时间程序。
（2）柱温设置
选中“Column Oven（柱温箱）”复选框，在“Oven Temperature（柱温箱温度）”中，设置柱温。CTO-20A/20AC、CTO-30AS柱温箱最高温度90℃，CTO-30A柱温箱最高温度160℃，也可设置为色谱柱的最高使用温度进而保护色谱柱。
（3）保存方法
整体方法编辑完成后，保存方法，同时下载方法，平衡仪器。
四
确定色谱柱，优化液质方法
LC-MS方法开发时，除考虑液相分离度，也要尽可能提高质谱检测灵敏度。如图，酸性流动相（甲酸水）能增加质谱正离子模式的灵敏度、降低负离子模式的灵敏度，碱性流动相（乙酸铵）反之。
1）优化脱剂管温度
可调节脱溶管温度影响目标化合物电离，操作者可对比200、250、300 deg.C的灵敏度，得到最佳脱溶管温度参数（如图最佳温度为300）：
2）优化Interface（接口）参数设置
可设置多通道检测，分别筛选0.25、0.5、1.0、2.0 kV接口电压的灵敏度。
3）调整喷雾针位置
喷雾针距离离子源越远，响应灵敏度降低。在实验中一般默认其x轴位置为+1（即伸出1mm），但是否为目标化合物最佳喷雾针位置，需要手动调整加以验证。这里需要注意的是，除喷雾针的位置外，其他参数均可以通过软件反控，因此可以使用批处理的方法进行优化。
液相质谱定量方法的开发，实质就是在保持各组分色谱峰良好分离度的前提下，兼顾各目标化合物的高响应灵敏度。流动相溶剂、流动相pH、色谱柱是影响液相分离效果的主要因素，MRM电压、脱溶剂参数、喷针位置是影响质谱灵敏度的主要因素，当分离度和灵敏度冲突时我们要优先满足分离度。
简而言之，液相质谱定量方法的建立与优化一般包括以下四步：一、实验前准备，保证系统正常运行；二、连接两通，优化MRM电压，建立MRM方法；三、筛选色谱柱，建立良好液相分离方法；四、在兼顾液相分离度同时，优化质谱检测灵敏度。希望今天的分享能够对大家有所帮助，期待您的点赞评论。
