转自：纳微科技
NW Dex G-25系列脱盐层析
预装柱的应用实例与讨论
前言
前面一篇推文《纳微科技“超级”分子筛来了》向大家展示了NW Super系列分子筛在高分辨蛋白拆分中的应用，而作为分子筛的另一个重要应用场景——分组分离，并没有详细讨论，这里我们就以NW Dex G-25系列分子筛为例，对分组分离进行探讨，而应用最多最广的非脱盐莫属。
分子筛应用于分组分离
分子筛应用于分组分离的原理和其他分子筛分离的原理是一致的，是按照组分分子量大小进行组分间分离，其妙处在于利用了待分离样品各组分分子量区间的一个点，这个点的两边很大范围内是没有任何组分的，可以恰好将待样品的众多分离组分在这个大小的分子量位置“斩开”而分成两组，一组为大分子量组，在分子筛层析的过程中先被洗脱下来，另一组为小分子量组，在层析过程中后被洗脱下来，这样待分离样品中的各组分就形成分成两个目标峰，典型的是死体积洗脱的各种蛋白的叠加峰和接近一个柱体积洗脱的各种小分子盐峰，当然这是理想状态（图1）。
图1：分组分离理想状态图谱
分组分离的实际应用
在实际的应用中，典型的组分离为酶促反应结束后，酶（大分子组）与底物以及缓冲盐（小分子组）的分离，另外遇到特别多的就是各种层析纯化后，收集正组分（一般为目标物纯度合格或达到合格标准的待合并组分）中蛋白、多糖、核酸等大分子目标物与各种层析流动相中的缓冲盐的分离，即脱盐（Desalting），这其中的盐包括反相纯化流动相中维持pH的缓冲盐，离子交换的维持pH的缓冲盐和增加洗脱能力的NaCl等，多数疏水层析中维持pH的缓冲盐和改变样品疏水性能的硫酸铵等。
在NW Dex G-25系列层析介质（表1）脱盐的实际操作过程中，一般以柱层析的方式来进行脱盐，多数为闭合的预装层析柱，少数为开放形式的重力柱、离心柱或者多孔板。脱盐柱的平衡流动相优选目标大分子后续处理或者保存所需的低电导缓冲液，少数比较稳定的样品会选用纯水，以降低最终产品中的盐浓度。
表1：NW Dex G-25系列层析介质性能参数表
在NW Dex G-25系列产品脱盐的过程中，一般会有几个参数影响脱盐工艺，分别是上样体积、填料粒径、柱床高度和工艺流速；
1.上样体积对脱盐效果的影响
一般脱盐柱的上样体积可以达到实际柱床体积的10%-40%乃至更高，但是这个相对上样体积和柱子的径高比有一定的关系，一般矮胖的柱床，上样量会低一些，瘦高的柱床，相对上样量会高一些。
以20mL的NmPREP 16/100, NW Dex G-25 F脱盐预装柱为例（图2），在相对上样体积4mL(20%CV)、6mL(30%CV)、8mL (40%CV)和10mL(50%CV)时，蛋白组分与盐峰分离度逐渐降低，脱盐率逐渐下降，以30%-40%CV上样量为最优。
图2：NmPREP 16/100, NW Dex G-25 F脱盐预装柱不同上样量结果对比
2.填料粒径对脱盐效果的影响
市面上G-25填料有粗颗粒（C，coarse）、中颗粒（M，medium）、细颗粒（F，fine）和超细颗粒（SF，superfine）四种不同平均粒径，其中超细颗粒由于压力流速曲线原因，只限于装填少数矮胖型小体积预装柱，用于早期脱盐工艺开发，不适合工业放大。
NW Dex G-25系列填料具有C、M和F三种粒径，用于实验室常规脱盐，并且适合工业放大，对比NmPREP 26/100, NW Dex G-25 C、NmPREP 26/100, NW Dex G-25 M和NmPREP 26/100, NW Dex G-25 F三种预装柱的在上样量30%CV时的脱盐结果（图3），可以看出不同粒径带来的分辨率的变化，随着填料平均粒径的降低，盐峰和蛋白峰的分离度有明显提高，或者说小颗粒由于其柱效和分辨率的提高，可以在一定程度上增加上样量，但同时，小颗粒会带来压力流速曲线的变化。
图3：不同粒径NmPREP 26/100, NW Dex G-25脱盐预装柱30%上样量结果对比
3.柱床高度对脱盐效果的影响
随着柱床高度的增加，脱盐柱理论塔板数增加，对脱盐工艺效果同样有增益，对比相同柱径，四种不同高度的脱盐预装柱：NmTRAP 5mL,NW Dex G-25 F(H=25mm)、两个NmTRAP 5mL,NW Dex G-25 F(H=50mm)串联、NmPREP 16/100,NW Dex G-25 F(H=100mm)和NmLOAD 16/400, NW Dex G-25 F(H=400mm)均为30%相对上样体积时的脱盐效果（图4），可以看出更高柱床时，盐峰与蛋白峰的分离度更好，这种提高来源于柱高带来的柱效增加，所以在实际的工业放大脱盐时，选择更高柱床的大颗粒脱盐柱，既可以保证脱盐效果，又不用担心高流速时高柱床带来的背压超限。
图4：不同柱高NW Dex G-25 F脱盐预装柱30%上样量
结果对比
4.工艺流速对脱盐效果的影响
在其他工艺参数不变时，更高的层析工艺流速代表着更高效率，脱盐工艺流速在不同粒径的NW Dex G-25填料中的影响不同，对比NmPREP 16/100,NW Dex G-25 C、NmPREP 16/100,NW Dex G-25 M和NmPREP 16/100,NW Dex G-25 F三种不同平均粒径脱盐预装柱在不同线性流速下的脱盐效果变化可以看出（图5），流速增高对细颗粒脱盐预装柱结果基本无影响，对中颗粒脱盐预装柱影响不明显，对粗颗粒脱盐柱影响较为明显，这主要是因为分子在较大粒径的填料颗粒中需要更多的扩散时间，与范德米特方程式中大粒径填料的最佳流速更低相符。
图5：流速对不同粒径NmPREP 16/100, NW Dex G-25脱盐预装柱结果影响
脱盐预装柱寡核苷酸纯化实例
另外，在最近比较火爆的寡核苷酸的不同纯化工艺中，如反相、离子交换和疏水等层析纯化步骤中，最终流动相的缓冲盐的去除是必不可少的步骤，我们在此也给大家带来了寡核苷酸脱盐的应用案例，以下是我们利用两种不同的脱盐预装柱NmPREP 16/100，NW Dex G-25 F和NmLOAD 16/500，NW Dex G-25 M对两种寡核苷酸在NmVALID 11/200，NanoQ-15L的预装柱进行离子交换层析纯化的高纯度收集组分进行分子筛脱盐的层析图谱（图6）。
图6：NW Dex G-25脱盐预装柱寡核苷酸脱盐应用实例
可见在相对上样体积30%的时候，两种脱盐预装柱都能对样品进行很好的脱盐，而且后者在多次上样时表现出很好的重现性。
关于脱盐的应用场景和工艺讨论，还可以有不同的角度，欢迎大家留言交流。
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