转自：药渡
荧光蛋白已广泛用于活细胞和生物体中的蛋白可视化[1]。虽然明亮的单体青色、绿色和黄色荧光蛋白已被陆续开发出来，但生成高亮度、完全成熟的单体红色荧光蛋白 (mRFP) 却被证明是十分困难的，因为它们天然存在的祖先是四聚体，并且只有在两个连续的自催化氧化步骤后才会发出荧光。在之前的研究中，科学家们利用广泛诱变得到了多种单体RFP，但它们的亮度和成熟效率都有所减损[2]。
2023年3月27日，来自阿姆斯特丹大学的T.W.J. (Dorus) Gadella团队及其合作者在Nature Methods上在线发表了题为mScarlet3: a brilliant and fast-maturing red fluorescent protein的研究文章。研究人员使用多参数筛选方法进化得到新型单体红色荧光蛋白mScarlet3。由于其β桶装结构内有一个新设计的疏水片状结构域，使其兼具高量子产率、高荧光寿命以及快速成熟的特性，可以作为融合标签在活细胞中实现更为高效的分子成像。
作者总结了研究中的发现，他们之前开发了三个高亮度的单体红色荧光变体，即 mScarlet系列。然而，固有亮度最高（由体外纯化蛋白测量得到）的变体mScarlet，在细胞中却因为蛋白成熟较慢且不完全，亮度反而不如以二聚体存在的mScarlet-I变体[3]。作者由此设想，如果可以将mScarlet-I的快速成熟特性和mScarlet的高发光效率结合在同一个蛋白质中，将能得到更为高效实用的红色荧光蛋白。
首先，作者希望进一步提高荧光蛋白的亮度，由于mScarlet和mScarlet-I仅在第74位氨基酸上有区别（分别为threonine和isoleucine），所以作者在mScarlet的基础上，threonine-74周围的 β 桶状结构内部引入了突变，并同时评估变体的荧光寿命和荧光强度。然而，增加亮度的突变通常在无意中降低了蛋白的成熟效率，而且增强成熟的突变往往难以预测，并经常在远离发色团的区域中。所以作者随后利用随机诱变用于寻找增强成熟效率和延长荧光寿命的突变。经过几轮靶向和随机诱变后，研究人员生成了两个新型变体mScarlet3和mScarlet-I3。
在细胞中，作者发现mScarlet3和mScarlet-I3分别比mScarlet亮76%和80%，比mCherry亮5倍多。24小时后，mScarlet3的成熟程度（96%）与之前已被证明快速成熟的mScarlet-I相同. mScarlet-I3的成熟程度比mScarlet-I更高（113%）。mScarlet3的成熟速度甚至是mScarlet的四倍，与mCherry一样快。除了荧光强度和成熟程度，其他因素也会限制荧光蛋白的应用，比如许多mRFP显示出严重的光致变色行为：在分别用蓝光和黄绿光连续照明后，它们的亮度和暗度可以分别提高两倍。作者在交替的蓝色和绿色激发下测试了两个变体的光致变色性，发现mScarlet3和mScarlet-I3都是非光致变色的；两个变体均显示单指数荧光衰减，寿命分别为 4.0 和3.6 ns。美中不足的是，mScarlet3的光稳定性略低于原始mScarlet，但mScarlet3的光稳定性已经足以允许其在活细胞共聚焦延时成像条件下进行1000次共聚焦扫描，而不会出现明显的光漂白。
图1. mScarlet3和mScarlet-I3的荧光特性
为了评估mScarlet3在体内的性能表现，作者首先比较了mScarlet和mScarlet3在斑马鱼幼虫中的亮度。在注射质粒后24小时，幼虫体内mScarlet3 的红色荧光强度相比mScarlet增加了两倍。之后，作者向胰腺外分泌细胞中注射表达H2B-mScarlet3的mRNA，在6小时的持续成像中可以观察到许多细胞经历有丝分裂的过程。因此，mScarlet3可用于斑马鱼幼虫细胞的体内成像。
图2. mScarlet3用于斑马鱼幼虫细胞的成像
总之，作者开发了一种新型单体红色荧光蛋白mScarlet3，结合了mRFP的高量子产率（75%）与mScarlet-I的高成熟效率两种特性，在活细胞和体内应用中作为融合标签表现出了出色的性能，且没有明显的细胞毒性和光致变色行为。
参考文献
[1] Chudakov, D. M.,Matz, M. V., Lukyanov, S. & Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and theirapplications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103–1163 (2010).
[2] Campbell, R. E.et al. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 7877–7882 (2002).
[3] Bindels, D. S. etal. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat. Methods 14, 53–56 (2017).
