转自：诺唯赞生物
您的实验还在出现 CT值偏大?
伴随数据重复性差的问题吗？
速来验证是否是基因表达量低的问题！
以及实验如何优化才能改善这类问题！
如何定义低表达量基因？
一般情况下，一个基因在某样本中的 RPKM 值比较低，则称为低表达量基因。在 qPCR 实验结果中体现为数据 CT 值偏大，有时伴随复孔重复性差的情况，CT值偏大表现为同体系内参基因 CT值正常，而目的基因 CT值在 30 以上（染料法）
图 1. 低表达量基因的表现形式
如何优化实验更好的检测低表达量基因？
01 程序优化
将 2 步法改为 3 步法程序
或延长延伸时间，提高扩增效率
02 实验操作优化
增加复孔数量，舍掉实验结果中偏差较大的数值；
可以引入一种不与目的基因发生反应且不干扰检测的 carrier DNA/carrier RNA，降低移液过程中靶基因附着在枪头或管壁产生的损耗。
03 反应体系优化
A
模板
模板纯度低、含抑制剂以及模板发生降解、模板投入量过低，均不利于 qPCR 实验的进行。
优化方式
RNA：琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，NanoDrop检测RNA纯度；逆转录：提高RNA模板投入量；
RNA：琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，NanoDrop检测RNA纯度；逆转录：提高RNA模板投入量；B
引物
非特异性扩增消耗引物和 Taq 酶，会降低引物与目标基因结合概率，从而影响扩增效率。
优化方式
引物符合引物设计原则，避免出现非特异性扩增，注意引物扩增效率需在90%-110%之间；
引物扩增效率的计算
将基因扩增产物进行梯度稀释(至少三个梯度)同时进行 qPCR，得到的 CT值仪器会自动拟合标准曲线，或将 CT值导入 Excel 中手动绘制标准曲线，将标准曲线中的斜率带入引物扩增效率的计算公式：
e = 10[−1/k]-1
（e:扩增效率，k:斜率）
C
试剂
不同 qPCR 试剂中的 Taq 酶、Buffer、Mg2+、荧光染料等成分配比不同，试剂的特异性和灵敏度也有所不同，影响扩增效率。
优化方式
检测低表达基因需要使用低表达检测专业试剂，诺唯赞 Taq Pro Universal SYBRqPCR Master Mix（Vazyme #Q712）助力低表达基因检测！
【稳定检测低表达体系 Q712】性能展示
低拷贝模板检测更灵敏
对支原体质粒模板进行6个10倍梯度稀释，可以看到Vazyme #Q712在检测低拷贝区质粒时具有优秀的扩增线型和线性关系，检出质粒拷贝数低至1.75拷贝（稀释至0.35 copies /μl，投入5 μl），且与本司之前的染料qPCR产品相比，在稀释至第6个梯度的最低检出线上Vazyme #Q712的CT值更小，灵敏度更高。
图 2. Q712 与本司原来产品在不同拷贝数下的扩增曲线
图 3.Q712 与本司原来产品在不同拷贝数下的 CT值
低拷贝模板检测更稳定
扩增单拷贝的目的片段时，单拷贝的检测率应符合泊松分布的设定检测率，在泊松分布的理论值中，1.75 拷贝数检出概率为 70%、未检出概率为 30%。分别使用 Vazyme #Q712 和市面同类型产品Supplier A 检测 1.75 拷贝的支原体质粒模板。结果显示，二者均符合泊松分布推测检出率，Vazyme #Q712 检出率为 75%优于 Supplier A 的检出率
图4.Q712与Supplier A在1.75拷贝数质粒上的检测情况
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