转自：舒泰神
在兴业证券去年一份专门讲述病毒载体的报告中，有专门论述腺病毒相关载体（AAV）的章节，现汇总如下，以便于读者加深对AAV产业链的理解：
病毒载体是一种常用的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入其他细胞进行感染的分子机制。病毒是一种由核分子和蛋白质构成的非细胞形态生物，能够携带基因进入受体细胞，经开发和改造后可用作 CGT 载体。由于病毒的多样性及宿主机体的高度复杂性，目前仅腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒和溶瘤病毒等少数种类可改造为 CGT 载体。（注：CGT是Cell & GeneTherapy即细胞与基因治疗的简称）
当前使用最广泛的两种病毒载体：腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)
在基因和细胞治疗中，使用的载体可以分为病毒载体和非病毒载体：迄今为止， 大多数基因疗法利用病毒载体来传递目标基因。据 Samantha L. Ginn综述文章的统计，在 1989-2017 年间基因治疗的所有临床试验中，使用病毒载体的临床占总数的 67.3%。根据《An Analysis Of The Gene Therapy Viral Vector Landscape》，目前常用的病毒载体包括腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）、仙台病毒、腺病毒 （AdV）、逆转录病毒和溶瘤病毒等，相比于腺病毒和逆转录病毒来说，慢病毒载体和 AAV 载体安全性较好，二者在临床试验中使用的数量也越来越多。非病毒载体主要有脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒，外泌体等。该类载体具有低免疫原型、低成本、易规模化生产等优点，但转染效率、细胞毒性、靶向性等问题还有待解决。
图1：1989-2017基因治疗中载体使用情况
腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)是当前使用最广泛的两种病毒载体，其中AAV常用于基因治疗，LV 常用于细胞治疗。AAV 基因组长度为4.8kB，其宿主范围极为广泛，长时程基因表达，治疗效果持久，同时其免疫原性极低，肝毒性低，但包装容量小，感染到表达的时间比较长。
腺相关病毒载体 1965 年被发现，1995 年第一次用于人类疾病治疗
腺相关病毒(AAV)最早于1965 年首次在实验室的腺病毒制剂中被发现，随后科学家对其进行了多角度的研究。1982 年成功完成了AAV2 基因组的克隆以及测序工作。1995 年，AAV 载体首次用于治疗人类的囊性纤维化病。进入 21 世纪后，科研人员发现了更多不同的 AAV 血清型家族，丰富了 AAV 载体的选择范围。2008 年，科研人员在治疗莱伯氏先天性黑蒙症时利用了基于 AAV 载体的基因疗法， 获得了良好的成果。2012年，第一个基于AAV用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症LPLD 的基因治疗药物 Glybera 获得了欧洲药品管理局 EMA 的批准。5 年后，治疗由 RPE65 基因突变导致的遗传性视网膜疾病的 AAV 基因治疗产品 Luxturna 获得美 国食品药品管理局 FDA 的批准。
图2：AAV载体的不同发展阶段
腺相关病毒是一种安全性较高的细小病毒
AAV 属于细小病毒科依赖性细小病毒属，它由一个直径约 26nm 的二十面体蛋白质衣壳和一个约 4.8kb 的单链 DNA 基因组组成，该基因组可以是正义链也可以是反义链。病毒衣壳由 VP1、VP2 和 VP3 三种亚基构成，三种亚基的比例为 1：1：10，共 60 份拷贝。目前的普遍共识是 AAV 病毒不会引起人类疾病，安全性非常高。
侵染细胞时，AAV 与细胞表面特异性受体结合，激活胞内信号通路，进而触发 AAV 通过受体介导的内吞作用进入细胞，在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核，随后病毒裂解，其单链 DNA 需复制成为双链 DNA 后表达目的基因。
AAV 载体改造策略：分型发现、设计及修饰
为了将野生型 AAV 变成适合体内基因递送的重组型 AAV 载体，研究人员对其进行了一系列的遗传改造。重组型 AAV 载体的病毒衣壳依然沿用野生型 AAV 的序列与构造，如完全剔除了 rep 基因和 cap 基因，仅仅保留有了负责引导病毒载体基因组复制和包装的 ITRs 序列。与野生型 AAV 相比，这种改造在很大程度上提高 AAV 载体的装载量并极大程度上降低了体内免疫原性和毒性。与 AAV 载体复制和装配相关的 rep、cap 基因元件以及腺病毒辅助基因元件被分别克隆到其它质粒载体上，这样的设计允许利用多质粒瞬转系统大量制备科研或者临床级别的重组 AAV 载体产品。
图片3：试验中不同启动子的情况
AAV 载体的优势与面临的挑战
AAV 载体具有器官靶向性、安全性高以及长效性等优点，但同时存在包装容量小、感染到表达的时间比较长等缺点。重组的 AAV2血清型病毒载体仍然处于主流位置。从 2003-2019 年的 144 项披露了 AAV 病毒衣壳数据的临床试验中分析发现，重组的 AAV2 血清型仍然处于主流位置，并且具有最多的安全性和有效性证据，截至 2019 年末已经有超过40 项使用 AAV2 病毒载体的临床试验完成全部流程。利用组织特异性启动子实现组织特异性表达成为新趋势。从104 项披露了启动子数据的临床试验中分析发现，像 CBA、CAG 和 CMV 等泛表达类的启动子依然受到研究者的广泛青睐，而在 2015-2019年间，超过 25 项临床试验使用了组织特异性启动子来实现特定组织的表达，例如白蛋白启动子和突触蛋白启动子等。
基于 AAV 载体的基因治疗临床试验数量猛增
截至 2022 年 6 月，在 ClinicalTrials.gov 上登记了 239 项以 AAV 为载体的基因治疗临床试验。2016 年-2022 年 6 月，临床以 AAV 为载体的基因治疗试验数量增长迅猛，从 2016 年的不足 10 个增至 2018 年 11 月的 145 个，再到 2022 年 6 月进一步提升至 239 个。尽管临床试验中所用最多的是基于 AAV2 血清型的载体， 但是新的血清型如 AAV8、AAV9 也在不断被用于临床试验。大多临床试验通过进行 I/II 期合并临床试验以加速研发进程。以 AAV 为载体的基因治疗主要靶向眼、肝、肌肉和脑部，其中尤以靶向眼部疾病的临床试验数量为多，占比约21%。
AAV 载体生产方式主要有三种，基于 Sf9 细胞的杆状病毒表达载体系统是实现大规模生产的重要方法
在 AAV 载体的生产中，目前主流的方法主要有三种：1、基于HEK293 细胞的三质粒转染系统；2、哺乳动物稳定细胞系；3、基于夜蛾昆虫细胞(Sf9)的杆状病毒表达载体系统。1、HEK293 三质粒共转染工艺的方法是研究级与临床前使用的 AAV 载体的主要生产方式；HEK293 三质粒转染中的质粒分别有：含 ITRs 和目的基因的顺式质粒、含 rep 和 cap 基因的反式质粒、提供 E2a/b、E4 和 VARNA 基因的 Ad 辅助质粒三种质粒，共转染 HEK293 细胞（表达 E1a 和 E1b 基因）来生产AAV 载体。此方法中细胞通常以半贴壁的方式培养，在转染后 2-3 天达到最高生产力，随着时间的推移失去活力。2、哺乳动物稳定细胞系：上世纪 90 年代，Clark 等人将 rep/cap 和 AAV 载体基因组克隆到表达质粒中，并使其稳定感染 Hela 细胞，首次建立了基于 Hela 的生产细胞系。近来开发的混合 rAAV/rAd 载体，将转基因载体和腺病毒元件同时递送，从而使稳定整合的AAV 基因在 Hela 细胞系中获得 rep-cap 的高表达。稳定细胞系生产可以消除常规生产中的外来辅助污染物（如外源性病毒、质粒污染物等）。但是稳转株内的基因产物可能组装成杂质，造成潜在的安全隐患。3、杆状病毒/Sf9 系统是在锥体夜蛾昆虫细胞(Sf9)中使用杆状病毒表达载体 (BEV)来生产AAV 病毒载体。该方法是利用携带 AAV 载体基因组的 BEV 感染 Sf9 细胞。由于杆状病毒具有辅助功能， BEV 系统与 Sf9 细胞系结合可以稳定表达，用于高滴度的大规模载体生产。
AAV生产工艺
AAV 的上游生产工艺包括传统的基于多层托盘的贴壁工艺（MT）与基于悬浮工艺的搅拌生物反应器及固定床生物反应器，有研究对上述三种生产装置在 200L、1000L 生产规模下的成本进行了计算和比较。
结果显示，在生产规模为 200L 时，单批可生产 12 单位剂量的 AAV 载体（单位剂量为 1014vg，对应年产能 600 剂），贴壁工艺和悬浮工艺的单位剂量成本（包括上游和下游步骤）没有差别，均为 2.5 万美元，而固定床工艺单位成本为 2.1 万美元。当生产规模提升到 1000L（对应一批次 60 剂，满产一年约 3000 剂）时， 贴壁工艺为 1.5 万美元，悬浮工艺为 1.2 万美元，固定床工艺为 0.8 万美元。进一步的支出分析表明，悬浮和固定床工艺的资本和劳动力成本相当，而贴壁工艺的成本在临床规模（200L）上与悬浮和固定床工艺接近。当生产规模达到 1000L 时， 贴壁工艺的劳动力成本会显著上升，而悬浮及固定床工艺几乎没有变化。总体而言，若使用基于一次性耗材的固定床工艺代替悬浮工艺，可以使得生物反应器的 USP 运营费用降低 30%至 40%，生物反应器的占地面积也可减少60%。
病毒载体工艺复杂，壁垒极高，扩大培养和纯化是技术难点。病毒载体生产分为上游（生产）工艺（USP）和下游（纯化）工艺（DSP）。上游生产工艺中， 细胞扩增、转染等关键缓解均有技术优化空间。细胞扩增方面，应用成熟的贴壁培养面临着大规模生产中处理复杂、容易污染、培养条件控制与检测困难等问题，悬浮培养和微载体培养通过对关键因素进行优化，一定程度上提升了大规模培养的便捷性，降低了污染风险。工业上常用的传染方式包括瞬时转染和稳定转染，两种方法各有优缺点，需要按照实际场景而使用。下游纯化工艺中，当前面 临的主要挑战是如何在最大程度提高产量的同时，满足产品与杂质的质量规范。去除产品中的污染物，将其杂质控制在监管标准许可的范围之内，是下游工艺最关注的技术细节。其中，安全且高效地分离空衣壳的方法是下游工艺改进的一大重点。
文章来源：兴业证券以上文字均摘录自——医药行业病毒载体专题报告：CGT关键原料，关注外包生产，本文仅供参考，不代表我们的任何投资建议。如需使用相关信息，请参阅报告原文。
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